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干貨:支原體檢測試劑盒的操作步驟及注意事項


操作步驟:
貼壁細胞
1、被檢細胞接種于無菌的 6 孔細胞培養板中,接種密度為 1-2×10 4 。同時,接種正常無支原體感染的同種細胞,作為陰性對照。
2、5 天后,先吸去培養液,再加入 1ml 的固定液,靜置 20min,
3、吸去固定液,晾干。
4、于每孔中,加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液(Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細胞),37℃避光放置 15-20min 或室溫靜置 20~30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液,加入 2ml 滅菌超純水洗滌三次,直接風干。風干后加入一滴封片液,并以蓋玻片覆蓋。
6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發光激發,觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。

懸浮細胞:
1、收集需檢測的細胞,1500rpm,5min。
2、將收集的細胞涂片于載玻片上,再加 1ml 的固定液,靜置 20min。
3、吸去固定液,晾干。
4、于每孔中,加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液(Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細胞),37℃避光放置 15~20min 或室溫靜置 20~30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液,用無菌水洗滌玻片 3 次,直接風干。風干后加入一滴封固液,并以蓋玻片覆蓋。
6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發光激發,觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。
結果判斷(參考):
陰性:僅見細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。
陽性:除細胞外,細胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。
 
注意事項:
1.Hoechst 工作液對人體有害,請注意防護。
2.固定液有刺激性氣味,建議在通風櫥進行固定。
3.支原體檢測時,最好用不含抗生素的培養液培養 2~3 代,這樣容易避免假陰性結果。
4.本試劑盒用于 6 孔板檢測時,可以進行 50 次檢測反應。
5. 檢測支原體污染, 可以使用支原體高效 Vero 細胞, 這樣可以提高檢測靈敏度, 即將被檢測樣品接種于 Vero細胞進行檢測。

素材來源于網絡。
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